賽默飛世爾（Thermo Fisher Scientific）是生命科學領域的品牌，提供了多種類型的實時熒光定量PCR（qPCR）儀器，其中7300和7500系列是其中應用廣泛的兩款機型。兩者均適用于基因表達分析、基因分型、相對定量檢測等多個領域。本文將詳細介紹賽默飛7300和7500實時熒光定量PCR儀器的主要功能、應用領域，以及如何在相對定量測定中使用這些儀器。

一、賽默飛7300和7500實時熒光定量PCR系統(tǒng)：賽默飛7300和7500 qPCR 儀器概述

1.1 7300 qPCR儀器

7300實時熒光定量PCR系統(tǒng)是一個多功能的qPCR平臺，專為中低通量實驗設計，適用于研究級別的應用。該儀器支持96孔板，具有高精度和高重復性，廣泛應用于基因表達定量、SNP基因分型以及微生物檢測等領域。

主要特點：

• 兼容SYBR Green、TaqMan等多種化學探針。

• 精確的溫控系統(tǒng)，確保PCR擴增過程中的穩(wěn)定性。

• 靈敏的檢測系統(tǒng)，能夠捕捉弱信號。

• 用戶友好的軟件界面，提供直觀的數(shù)據(jù)分析工具。

7300 PCR系統(tǒng)設計緊湊，操作簡便，非常適合小型實驗室或初學者使用。

1.2 7500 qPCR儀器

7500實時熒光定量PCR儀器則是7300的升級版本，具備更高的靈敏度和更廣泛的應用能力。7500系列包括7500標準型和7500 Fast型兩個版本，前者是常規(guī)應用的理想選擇，而后者則在縮短實驗周期和提高通量方面表現(xiàn)出色。

主要特點：

• 支持SYBR Green、TaqMan探針以及其他熒光探針系統(tǒng)。

• 快速模式能夠在更短時間內(nèi)完成qPCR循環(huán)。

• 適合多重定量PCR，可同時檢測多個目標。

• 提供更廣泛的溫度梯度，支持更復雜的PCR實驗。

• 精準的光學系統(tǒng)和多通道熒光檢測。

7500系統(tǒng)適用于需要快速結(jié)果的高通量實驗，特別是在臨床診斷、藥物研發(fā)以及環(huán)境監(jiān)測等領域的應用中表現(xiàn)優(yōu)異。

二、賽默飛7300和7500實時熒光定量PCR系統(tǒng)：相對定量PCR原理及其在7300和7500上的應用

2.1 相對定量PCR原理

相對定量PCR是指通過實時監(jiān)測目標基因和內(nèi)參基因在PCR擴增過程中產(chǎn)生的熒光信號，來計算目標基因的表達水平相對于內(nèi)參基因的變化。該方法的核心思想是在檢測樣本和標準樣本之間比較目的基因的表達量變化，從而得出實驗樣本中的基因相對表達量。

通常情況下，相對定量PCR實驗涉及以下幾個關(guān)鍵步驟：

1. RNA提取與反轉(zhuǎn)錄： 從細胞或組織中提取總RNA，隨后通過逆轉(zhuǎn)錄反應將RNA轉(zhuǎn)化為cDNA。

2. qPCR反應： 在7300或7500系統(tǒng)中，使用SYBR Green或TaqMan探針設計的引物對目標基因和內(nèi)參基因進行擴增，同時實時監(jiān)控熒光信號的積累。

3. 數(shù)據(jù)分析： 通過標準化方法，將目標基因的表達量相對于內(nèi)參基因進行計算，通常采用△△Ct方法（也稱作2^-△△Ct方法）來得到相對表達量。

2.2 在7300和7500系統(tǒng)上的應用

7300和7500 qPCR儀器均可以出色地執(zhí)行相對定量分析。在相對定量分析中，數(shù)據(jù)的準確性和重復性是關(guān)鍵，因此儀器的溫控精度、熒光探測靈敏度和軟件的數(shù)據(jù)處理能力都直接影響實驗結(jié)果。

7300系統(tǒng)中的相對定量測定：

• 7300系統(tǒng)雖然相對基礎，但其穩(wěn)定的光學和溫控性能仍然能夠支持相對定量PCR的準確測量。對于研究級的實驗室或小規(guī)模的定量研究，7300能夠提供可靠的數(shù)據(jù)。

• 利用SYBR Green或TaqMan化學探針，用戶可以監(jiān)測目標基因和內(nèi)參基因的Ct值，隨后使用配套的軟件計算相對定量數(shù)據(jù)。

7500系統(tǒng)中的相對定量測定：

• 7500系統(tǒng)在性能上優(yōu)于7300，尤其是7500 Fast型，通過更快的熱循環(huán)和高效的光學檢測系統(tǒng)，大幅縮短了實驗時間，同時保證了數(shù)據(jù)的精度。對于需要處理大量樣本的實驗，7500可以更高效地完成相對定量分析。

• 7500系統(tǒng)還提供了更多的熒光通道，支持多重熒光標記，可以同時對多個基因進行相對定量分析。這種功能在復雜實驗設計中尤其有用，如同時分析多個靶基因和內(nèi)參基因的表達量。

三、7300和7500系統(tǒng)中相對定量PCR的實驗設計

3.1 樣本準備

在進行相對定量PCR之前，確保樣本的RNA質(zhì)量高且一致。劣質(zhì)的RNA樣品會影響逆轉(zhuǎn)錄效率和后續(xù)的qPCR擴增效率，進而導致不準確的定量結(jié)果。因此，實驗開始前的RNA純化步驟至關(guān)重要。

• 內(nèi)參基因選擇： 選擇一個或多個穩(wěn)定表達的內(nèi)參基因（如GAPDH、ACTB等）進行標準化處理。理想的內(nèi)參基因在實驗條件下應保持穩(wěn)定表達，否則會引入誤差。

3.2 qPCR反應設置

• 引物設計： 無論使用SYBR Green還是TaqMan探針，均需確保引物的特異性和擴增效率。確保目標基因和內(nèi)參基因的引物具有相似的擴增效率是相對定量實驗的基礎。

• 反應體系： 實驗中需要優(yōu)化反應體系的條件，如Mg2?濃度、退火溫度等，以確保最佳的擴增效率和反應特異性。賽默飛的7300和7500系統(tǒng)支持溫度梯度優(yōu)化，可以幫助快速找到最佳條件。

3.3 數(shù)據(jù)獲取與分析

在qPCR實驗完成后，系統(tǒng)將生成Ct值（Cycle threshold），表示熒光信號達到設定閾值所需的循環(huán)數(shù)。相對定量實驗中，關(guān)鍵是通過計算△Ct值（目標基因與內(nèi)參基因的Ct差值），并使用2^-△△Ct公式計算相對表達水平。

數(shù)據(jù)分析步驟：

1. 計算每個樣本的目標基因與內(nèi)參基因的△Ct值。

2. 比較實驗樣本和對照樣本之間的△Ct值，計算△△Ct。

3. 使用2^-△△Ct公式計算目標基因在實驗樣本中的相對表達水平。

賽默飛7300和7500系統(tǒng)配備了用戶友好的數(shù)據(jù)分析軟件，可以自動計算△Ct和△△Ct值，生成直觀的相對定量數(shù)據(jù)，方便研究人員快速得出結(jié)論。

四、7300和7500 qPCR系統(tǒng)的優(yōu)勢

7300和7500系統(tǒng)在實際應用中有諸多優(yōu)勢，特別是在相對定量PCR實驗中的表現(xiàn)。

• 高靈敏度檢測： 兩款儀器均配備高靈敏度光學檢測系統(tǒng)，能夠檢測到極低濃度的目標基因表達，適合低豐度基因的定量分析。

• 高精度溫控： 精確的溫度控制對于PCR反應的成功至關(guān)重要。7300和7500系統(tǒng)具備高精度的溫控模塊，確保每一個PCR循環(huán)的穩(wěn)定性。

• 數(shù)據(jù)處理便捷： 配套的軟件系統(tǒng)支持豐富的分析功能，用戶可以輕松完成數(shù)據(jù)標準化、定量分析及結(jié)果可視化。

五、結(jié)論

賽默飛7300和7500 qPCR系統(tǒng)在實時熒光定量PCR實驗中表現(xiàn)出色，特別是在相對定量分析中，其靈敏度、精確的溫控系統(tǒng)以及強大的數(shù)據(jù)分析軟件，使其成為生命科學研究中的重要工具。7300系統(tǒng)適合中小規(guī)模實驗室的研究應用，而7500系統(tǒng)則以其更快的反應速度和多通道檢測能力適用于大規(guī)模高通量分析。無論是基礎研究還是臨床診斷，這兩款儀器都能夠滿足用戶的多樣化需求。